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猪蓝耳病毒RT-PCR检测试剂盒

产品编号:SP002

检测方法:普通PCR 检测

检测样品:血液或组织

规格:25T/50T


  

猪蓝耳病毒RT-PCR检测试剂盒




【产品名称】

通用名称:猪蓝耳病毒RT-PCR检测试剂盒

英文名称:Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus RT-PCR Detection Kit

【包装规格】 10 T/ 50 T/

【预期用途】

本试剂盒适用于猪蓝耳病毒检测,可用于临床猪蓝耳病毒感染的辅助诊断,但不作确诊使用。

【检验原理】

利用离心柱内硅基质膜提取RNA,在反转录酶的作用下,以RNA为模板,以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TaqDNA聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火、中温延伸的循环,使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过35次循环,最终使扩增DNA片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳,经染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到DNA片段的扩增带。

 

【主要组成成份】

 

组成

10T/

50T/

PRRSV RT-PCR反应液

150 μL×1

750 μL×1

PRRSV 混合

30 μL×1

150 μL×1

PRRSV 阳性对照

40 μL×1

40 μL×1

PRRSV 阴性对照

40 μL×1

40 μL×1

0.2 mL薄壁PCR

12

60

50TAE电泳缓冲液(50倍稀释后使用)

20 ml

100 ml

染色液

20 µL

50 µL

上样缓冲液

40 µL

200 µL

制备管

10

50

2 ml 离心管

20

100

1.5 ml 离心管

10

50

Buffer V-L(病毒裂解液)

2.4 ml

12 ml

Buffer V-N(蛋白去除液)

0.8 ml

4 ml

Buffer W1A concentrate(洗涤液)

4.8 ml

24 ml

Buffer W2 concentrate(去盐液)

4.8 ml

24 ml

Buffer TEnuclease-free

0.8 ml

4 ml

说明书

1

1

注:阴性对照为猪基因组DNA,阳性对照为失去活性的猪蓝耳病毒cDNA

 

【储存条件及有效期】-20℃以下保存,避免反复冻融,有效期12个月。

 

【需自备的物品】

1.仪器:分析天平、离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、微波炉、-20 ℃冰箱、可调移液器(2 µL20 µL200 µL1000 µL)。

2.耗材:眼科剪、眼科镊、称量纸、20 mL一次性注射器、生理盐水、琼脂糖、500 mL量筒、500 mL锥形瓶、经焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理的灭菌1.5mL离心管和吸头(10 µL200 µL1000 µL)、灭菌双蒸水。

 

【注意事项】

1.病毒具有很强的感染能力,操作前必须准备好各种防御措施。

2.操作时须严格按照步骤进行,废物必须放入含消毒液的废物缸,以免污染实验室和工作人员。

3.为避免其他核酸的污染而出现假阳性,必须使用不含DNARNA的离心管、吸管、枪头、试剂和手套,操作人员须戴口罩。

4.Buffer V-LBuffer V-NBuffer W1A含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。

 

【实验准备】

第一次使用时,请在Buffer W1 ABuffer W2 concentrate中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇;

准备异丙醇(1%冰乙酸):即99ml异丙醇中加入1ml冰乙酸,混合均匀,室温密闭储存;

如果是提取病毒RNA,请选用RNase free Tip枪头和1.5 ml离心管或将枪头和离心管用0.1% DEPC水处理后再使用。

 

【操作步骤】

1.样本要求:

(1) 血液或血清样品:使用无菌注射液抽取样品置于离心管中待检。

(2) 肌肉或内脏样品(如肺脏、脾脏、淋巴结):取样本20 g,加少量灭菌PBS,用无菌研磨器研磨至糊状,再用4倍体积的PBS稀释成乳剂,8000 rpm 4℃离心10 min,取上清待检。

(3) 应避免标本间交叉污染。

(4) 标本收集后可立即检测;若不能立即检测,可置于28℃冷藏过夜保存;如需长期保存,标本应冻存于-80℃以下,避免反复冻融。

2. 样品处理:每份样品分别处理。

1)无细胞体液样品处理:收集200 µL样品,转入到1.5 ml离心管中;

2)全血样品处理:待血凝后取血清 200 µL , 转入到1.5 ml离心管中;

3)组织样品处理:每份组织分别从三个不同的位置称取样品约 1g ,用手术剪碎混匀后取 ,用手术剪碎混匀后取 0.05 g于研磨器中,加入1.5 mL生理盐水继续充分研磨,待匀浆后转至1.5 mL 灭菌离心管中,12,000 rpm离心 5 min,取上清液 200 µL 1.5 mL离心管中。

3. 提取过程:

1)向上一步转入样品的1.5 mL的离心管中,加入200 µL Buffer V-L,涡旋振荡混合均匀,静置5 min

2)加入75 µL Buffer V-N,涡旋振荡混合均匀后,于12,000 rpm离心5 min

3)将上清液转移到新的2mL离心管(试剂盒内已提供)中,加300 µL异丙醇(1%冰乙酸),上下倒置6-8次,混合均匀。

4)将制备管置于2ml离心管(试剂盒内提供)中,取上一步骤中的混合液移入制备管中,6,000 rpm离心1 min

5)弃滤液,将制备管放回到2 ml离心管中,加入500 µL Buffer W1A(确认已按要求加入无水乙醇),室温静置1min,于12,000rpm离心1 min

6)弃滤液,将制备管放回到2 ml离心管中,加入800 µL Buffer W2(确认已按要求加入无水乙醇),于12,000 rpm离心1 min

7)将制备管放回到2 ml离心管中,12,000 rpm离心1 min

8)将制备管置于洁净的1.5 ml离心管(试剂盒内已提供)中,在制备管膜中央加入40-60 µL Buffer TEnuclease-free),室温静置1min,于12,000rpm离心1-2min洗脱DNA/RNA

注:洗脱体积越大,洗脱效率越高。如果需要DNA/RNA浓度较高,可以将洗脱的DNA/RNA再次过柱离心洗脱一次;或适当减少洗脱体积, 但是最小体积不应少于30 μl,体积过小降低洗脱效率,减少RNA产量。

4. RT-PCR扩增

每份总体积20 µL,含15 µL RT-PCR反应液(用前混匀),3µL 混合酶液,2 µL模板RNA

例如:n份样品,配制n+1份,15×n+1RT-PCR反应液, 3×n+1)混合酶液匀后取18 µL分装成n份,分别加入2 µL模板RNA,作好标记。

PCR扩增仪上进行以下程序:50 ℃ 10 min94 ℃ 3 min;循环94℃ 30 s55 ℃ 30 s72 ℃ 30 s,共35次;再72 ℃延伸7 min

5. 电泳

1.5 g琼脂糖放于500 mL锥形瓶中,加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液100 mL(取2 mL 50TAE电泳缓冲液,用双蒸水稀释至100 mL),于微波炉中熔解,再加入50 µL染色液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物10 µL点样于琼脂糖凝胶孔中,以110120V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳,紫外灯下观察结果。

 

【结果判定】

阳性对照出现160 bp扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品出现160bp扩增带;结果判读160bp扩增带为猪蓝耳病毒阳性,否则为阴性。

                 


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